ISOMERIZAÇÃO DE ÁCIDOS DE AMARGOR DURANTE O PROCESSO DE PRODUÇÃO CERVEJEIRA

Michal P. Dybowski, Rafal Typek, Katarzyna Bernacik and Andrzej L. Dawidowicz

Maria Curie-Skłodowska University, Faculty of Chemistry, Department of Chromatographic Methods,
Maria Curie-Skłodowska Sq.3, 20-031 Lublin, Poland Email: m_dybowski@interia.pl

A cerveja é a bebida alcoólica mais antiga e mais amplamente consumida no mundo. A transformação de ácidos de amargor para iso-alfa e iso-beta-ácidos é reconhecida como o passo chave da produção de cerveja. O artigo demonstra e discute a cinética da transformação de alfa- e beta-ácidos em sua forma iso-. Seguindo os experimentos executados, a maior quantidade de isômeros dos ácidos de amargor são formados  no processo de produção executado a 80˚C por mais de 100 minutos. Os dados apresentados estão em boa conformidade com o conhecimento de cervejeiros experientes que aprenderam sobre o processo cervejeiro se baseando em testes sensoriais.

Palavras-chave: ácidos de amargor, isomerização, processo cervejeiro, preparação do mosto

1. INTRODUÇÃO

A cerveja é uma das bebidas alcoólicas mais antigas e mais amplamente consumidas no mundo. É bem sabido entretanto, que sua produção não é trivial e envolve vários passos. A preparação do mosto é reconhecida como o passo-chave da produção cervejeira. A mistura correta de malte de cevada com cones ou extrato de lúpulo é a essência deste processo. A adição de lúpulo não somente aumenta a durabilidade da cerveja, mas sobretudo, dá à cerveja um gosto amargo específico que resulta da presença de ácidos de amargor sendo o maior composto orgânico ocorrente nos cones de lúpulo.

Ácidos de amargor podem ser divididos em três grupos básicos: alfa-ácidos, beta-ácidos e gama-ácidos. Alfa-ácidos (cohumulona, n-humulona, adhumulona) e beta-ácidos (colupulona, n-lupulona, adlupulona), chamados frequentemente de ácidos de amargor, são primordialmente importantes para a produção de cerveja. Como resultados da literatura [1,2], estes ácidos, aquecidos em uma solução de água/álcool, isomerizam para iso-alfa e iso-beta-ácidos. No processo de produção cervejeira, a isomerização dos alfa- e beta-ácidos ocorre durante a adição de lúpulo ao mosto fervente. O nível desta isomerização, e assim, a intensidade do sabor da cerveja, é altamente dependente da temperatura e tempo de fervura na preparação do mosto [3-9].

O objetivo destes experimentos era encontrar o efeito das condições da temperatura no nível de transformação dos ácidos de amargor. O nível da transformação dos ácidos de amargor foi examinado durante um processo cervejeiro simulado, utilizando o modelo de mistura aquosa-alcoólica de um extrato de lúpulo. O problema científico apresentado parece estar justificado, pois não existem dados literários demonstrando a cinética da transformação de alfa- e beta-ácidos em sua forma iso-.

2- EXPERIMENTO

2.1 Materiais

Metanol (CLAE), etanol 96% e acetato de amônio foram comprados da Polskie Odczynniki Chemiczne S.A. POCh (Gliwice, Polônia). Extrato de lúpulo de amargor (Magnum) foi obtido da INS Pulawy. Padrões analíticos dos ácidos de amargor Sigma-Aldrich Co. (Alemanha).

A água foi purificada no sistema Milli-Q da Millipore (Bedford, MA, EUA)

2.2 Métodos

2.2.1 Preparação da amostra

As investigações da transformação de ácidos de amargor foram executados pelo aquecimento sob refluxo de solução etanólica de extrato de lúpulo em mistura etanol/água sob refluxo.

A solução etanólica de extrato de lúpulos de amargor continha 1g deste extrato em 10cm³ de etanol. A mistura aquecida continha 100 mm³ da solução etanólica de extrato de lúpulo de amargor em 100 cm³ da mistura etanol/água, 5% v/v.

Para que se pudesse eliminar o possível impacto de interferentes no processo de isomerização dos ácidos de amargor, a solução preparada não continha cevada maltada nem levedura.

Soluções individuais foram aquecidas por 200 minutos a temperaturas: 50, 60, 70, 80 ˚C. Amostras foram coletadas a cada 20 minutos. Subsequentemente, cada solução obtida foi sujeita a análise LC-MS-PDA (Cromatografia líquida com espectrômetro de massa e arranjo de fotodiodos).

O equipamento aplicado LC-MS-PDA foi calibrado usando padrões estatísticos da humulona e lupulona. As soluções utilizadas foram obtidas de diluições em série da solução principal com etanol para se obterem as seguintes concentrações de analitos (n=5):

Cohumulona: 5, 10, 25, 50 e 100 mg/cm³

Nadhumulona: 5, 10, 25, 50 e 100 mg/cm³

Colupulona: 1, 2.5, 5, 10 e 25 mg/cm³

Nadlupulona: 1, 2.5, 5, 10 e 25 mg/cm³

Iso-cohumulona: 0.05, 0.1, 0.5, 1 e 5 mg/cm³

Iso-colupulona: 0.05, 0.1, 0.5, 1 e 5 mg/cm³

Iso-nadhumulona: 0.5, 1, 2.5, 5 e 10 mg/cm³

Iso-nadlupulona: 0.5, 1, 2.5, 5 e 10 mg/cm³

As curvas de calibração resultantes mostram em todos os casos uma boa linearidade:

Cohumulona: R² = 0.9968;

Nadhumulona: R² = 0.9957;

Colupulona: R² = 0.9984;

Nadlupulona: R² = 0.9967;

Iso-cohumulona: R² = 0.9935;

Iso-colupulona: R² = 0.9963;

Iso-nadhumulona: R² = 0.9945;

Iso-nadlupulona: R² = 0.9978;

2.2.2 Medições CLAE

As medidas cromatográficas foram feitas usando LC-MS (LCQ Advantage Max) equipado com sistema espectrométrico de armadilha de íons (ThermoElectron Co. San Jose, CA). Uma coluna Gemini C18 (4.6 x 100mm, 3 um) (Phenomenex, USA) foi empregado para a separação cromatográfica. A separação cromatográfica foi feita usando uma eluição isocrática 35% A e 65% B. A fase móvel foi uma mistura de solvente A (20 nM de acetato de amônio na água) e solvente B (20 nM de acetato de amônio em metanol). Fluxo era 0.65 cm³/min. Durante o curso de cada análise, vários espectros da espectrometria de massas na variação 100-1000 m/z foram coletadas continuamente. O efluente da coluna foi ionizado por electrospray (ESI).

Em todas as soluções de ácidos de amargor, a função SIM foi utilizada para melhor visualizar a separação cromatográfica. Os compostos monitorados, suas proporções m/z e tempos de retenção foram como à seguir:

Cohumulona: (347 m/z, 7.1 min),

Nadhumulona: (361 m/z, 7.9 min),

Colupulona: (399 m/z, 9.25 min),

Nadlupulona: (413 m/z, 11.3 min),

Iso-cohumulona: (347 m/z, 15.1 min),

Iso-colupulona: (361 m/z, 20.6 min),

Iso-nadhumulona: (399 m/z, 22.8 min),

Iso-nadlupulona: (413 m/z, 31.7 min).

3. RESULTADOS E DISCUSSÕES

A Fig. 1 apresenta como exemplo o cromatograma do extrato de lúpulo de amargor em uma mistura de etanol/água aquecido a 80˚C por 60 minutos. Como demonstra o cromatograma, quatro ácidos de amargor e quatro dos seus isômeros estão presentes no extrato examinado. Eles são: Iso-cohumulona, iso-nadhumulona, iso-colupulona, iso-nadlupulona (picos 1-4, respectivamente) e cohumulona, nadhumulona, colupulona, nadlupulona (picos, 5-8 respectivamente). Todos eles foram identificados e confirmados na base de dados de retenção dos seus padrões, espectros PDA e dados da espectrometria de massas sequencial. As estruturas destes compostos são demonstrados na Fig. 2.

Como foi mencionado na Introdução, o mais desejado no processo cervejeiro é a formação de iso-ácidos de amargor solúveis em água. Por esta razão, dois parâmetros básicos e cruciais, temperatura e tempo de aquecimento do mosto, são otimizados no processo cervejeiro. Fig. 3 mostra a influência do tempo nas mudanças da concentração dos ácidos de amargor (Fig. 3 A-D) e seus isômeros (Fig. 3 A’-D’) durante o processo simulado de mostura realizado em diferentes temperaturas. Os resultados apresentados levaram às seguintes conclusões:

- alongamento do tempo de aquecimento resultou na diminuição da concentração de ácidos de amargor e simultaneamente em um aumento no conteúdo de isômeros correspondentes (compare as curvas nas Fig. 3 A-D e Fig. 3 A’-D’). Este fenômeno é óbvio e resulta do processo da isomerização dos ácidos de amargor.

- o aumento da temperatura do processo cervejeiro acelera a transformação de ácidos de amargor, o que é conectado com a influência da temperatura ao tempo de reação.

- as maiores mudanças da concentração dos ácidos de amargor e seus isômeros são observados a 80˚C. Deve ser notado que a concentração de beta-ácidos, após 100 min de aquecimento a 80˚C, cai para 0 mg/cm³ (veja Fig. 3 D). Em consequência disso, a concentração dos isômeros correspondentes no mosto aquecido é constante (veja dados para iso-nadlupulona e iso-colupulona – linhas sólidas com cruzes e triângulos na Fig. 3 D’) ou começa a assentar (veja dados para iso-nadhumulona e iso-cohumulona – linhas sólidas com diamantes e quadrados na Fig. 3 D’).

Fig. 1. Cromatograma de exemplo do extrato de lúpulos de amargor em mistura de etanol/água aquecida por 60 minutos a 80˚C. Os números de pico correspondem a: iso-cohumulona (pico 1), iso-nadhumulona (pico 2), iso-colupulona (pico 3), iso-nadlupulona (pico 4), cohumulona (pico 5), nadhumulona (pico 6), colupulona (pico 7), nadlupulona (pico 8). Parâmetros: Tempo (min) x Abundância Relativa (%).

Fig. 2. Estruturas dos ácidos de amargor identificados e seus isômeros

4. CONCLUSÕES

A intensidade do sabor do amargor de uma cerveja é altamente dependente no nível de transformação de ácidos de amargor para iso-alfa- e iso-beta-ácidos. Como resultados dos experimentos efetuados, o nível desta isomerização é fortemente dependente da temperatura e tempo da preparação do mosto. As maiores quantidades de isômeros de ácidos de amargor foram formados no processo cervejeiro realizado a 80˚C por mais de 100 min. Estes dados estão em boa conformidade com o conhecimento de cervejeiros experientes que aprenderam sobre o processo cervejeiro baseado em testes sensoriais. A cinética da transformação de ácidos de amargor demonstrada é relevante e útil para cervejarias nas quais o processo de produção é otimizado para uma escala industrial.

Fig. 3. Influência de tempo de aquecimento e temperatura nas mudanças de concentração de ácidos de amargor (A-D) e seus isômeros (A’-D’) em um processo cervejeiro simulado. Linha com quadrado – nadhumulona e iso-nadhumulona, linha com diamantes – cohumulona e iso-cohumulona, linha com cruzes – nadlupulona e iso-nadlupulona, linha com triângulos – colupulona e iso-colupulona. Parâmetros: Tempo (min) x Concentração (mg/l)

Referências bibliográficas

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Artigo original: https://journals.umcs.pl/aa/article/download/2497/1837